Forskel mellem sydlige, nordlige og vestlige blotting | Southern vs Northern vs Western Blotting

Nøgleforskel - Northern vs Southern vs Western Blotting

Detektion af specifikke sekvenser af DNA, RNA og proteiner er afgørende for forskellige typer af studier i molekylærbiologi. Gelelektroforese er en teknik, der adskiller DNA, RNA og proteiner i overensstemmelse med deres størrelser. Fra gelprofilerne detekteres en bestemt DNA-sekvens, RNA-sekvens eller protein ved hjælp af de specielle teknikker, der kaldes blotting og hybridisering med mærkede prober. Der er tre forskellige typer blotting metoder nemlig sydlige, nordlige og vestlige. Nøgleforskellen mellem nordlig sydlig og vestlig blotting ligger ved typen af molekylet det detekterer fra en prøve. Southern blotting er en metode, som detekterer en specifik DNA-sekvens fra en DNA-prøve. Northern blotting er en teknik, som detekterer en specifik RNA-sekvens fra en RNA-prøve. Western blotting er en metode, som detekterer et specifikt protein fra en proteinprøve.

INDHOLD

1. Oversigt og nøgleforskel

2. Hvad er Southern Blotting

3. Hvad er Northern Blotting

4. Hvad er Western Blotting

5. Side om side sammenligning - Northern vs Southern vs Western Blotting

6. Sammendrag

Hvad er Southern Blotting?

Southern blotting teknik blev udviklet af E. M. Southern i 1975 for identifikation af en specifik DNA-sekvens fra en DNA-prøve. Dette er den første blottingsteknik, der introduceres i molekylærbiologi. Det muliggjorde påvisning af specifikke gener fra DNA'et, specifikke fragmenter fra DNA osv. Der er flere trin involveret i Southern Blotting-teknik. De er som følger.

DNA isoleres fra prøven og fordøjes med restriktionsendonukleaser.
Fordøjet prøve skilles ad af agarosegelelektroforese.
DNA-fragmenter i gelen denatureres til enkelte tråde ved anvendelse af en alkalisk opløsning.
Enkeltstrenget DNA overføres til en nitrocellulosefiltermembran ved kapillær overførsel.
Overført DNA fastgøres permanent på membranen.
Fast DNA på membranen hybridiseres med mærkede prober.
Ubundet DNA vaskes fra membranen ved vask.
Røntgenfilm udsættes for membranen, og en autoradiograf fremstilles.

Southern blotting anvendes til forskellige aspekter af molekylærbiologi.Det er nyttigt i RFLP kortlægning, retsmedicinske undersøgelser, DNA-methylering i genekspression, påvisning af muterede gener i genetiske sygdomme, DNA-fingeraftryk mv.

Figur 01: Southern Blotting Technique

Hvad er Northern Blotting?

Northern blotting er en metode designet til at detektere en specifik RNA-sekvens eller mRNA-sekvens fra en prøve for at studere genekspression. Denne teknik blev udviklet af Alwine, Kemp og Stark i 1979. Det adskiller sig fra de syrlige og vestlige blottingsteknikker på grund af flere trin. Denne teknik udføres imidlertid også via gelelektroforese, blotting og hybridisering med specifikke mærkede prober og påvisning. Northern blotting teknik udføres som følger.

RNA ekstraheres fra prøven og separeres ved gelelektroforese.
RNA overføres fra gelen til en blottemembran og fastgøres.
Membranen behandles med en mærket probe fremstillet ud fra cDNA eller RNA (proben er komplementær til en specifik sekvens i prøven).
Sonden inkuberes med membranen for at binde med en specifik sekvens.
Ubundne prober vaskes af.
Hybridiserede fragmenter detekteres af en autoradiograf.

Northern blotting er et vigtigt værktøj til detektion og kvantificering af hybridiseret mRNA, undersøgelse af RNA-nedbrydning, evaluering af RNA-halveringstid, påvisning af RNA-splejsning, undersøgelse af genekspression, etc.

Figur 02: Northern Blotting

Hvad er Western Blotting?

Western blotting er en metode til at detektere et specifikt protein fra en proteinblanding ved anvendelse af mærket antistof. Derfor er western blot også kendt som en immunoblot . Denne teknik blev introduceret af Towbin et al i 1979 og udføres nu rutinemæssigt i laboratorierne til proteinanalyse. Trin er som følger.

Proteiner ekstraheres fra prøven
Proteiner adskilles af deres størrelser ved anvendelse af polyacrylamidgelelektroforese
Separerede molekyler overføres til en PVDF-membran eller nitrocellulosemembran ved elektroporation
Membranen er blokeret for uspecifik binding med antistoffer
Overførte proteiner er bundet med primært antistof (enzymmærkede antistoffer).
Membranen vaskes for at fjerne ikke-specifikt bundet primære antistoffer
Bundet antistoffer detekteres ved tilsætning af et substrat og detektering af det farvede bundfald dannet

Western blotting er nyttig til påvisning af anti-HIV antistoffer i en human serumprøve. Western blot kan også bruges som en bekræftende test for infektion med hepatitis B og en endelig test for galskygsygdom.

Figur 03: Western Blotting

Hvad er forskellen mellem Northern Southern og Western Blotting?

- diff Artikel Mellem før tabellen ->

Northern vs Southern vs Western Blotting
Type af molekyledetekteret
Northern Blotting	Northern blotting detekterer en specifik RNA-sekvens fra en RNA-prøve.
Southern Blotting	Southern blotting detekterer en specifik DNA-sekvens fra en DNA-prøve.
Western Blotting	Western blotting registrerer et specifikt protein fra en proteinprøve.
Type gel
Northern Blotting	Denne bruger Agarose / formaldehyd-gel.
Southern Blotting	Dette bruger en Agarose gel.
Western Blotting	Dette bruger polyacrylamidgel.
Blotting Method
Northern Blotting	Dette er en kapillær overførsel.
Southern Blotting	Dette er en kapillær overførsel.
Western Blotting	Dette er en elektrisk overførsel.
Prober anvendt
Northern Blotting	cDNA eller RNA-prober mærket radioaktivt eller ikke-radioaktivt.
Southern Blotting	DNA-prober mærkes radioaktivt eller ikke-radioaktivt.
Western Blotting	Primære antistoffer anvendes som prober.
Detection System
Northern Blotting	Dette gøres ved hjælp af en autoradiograf eller detektion af lys eller farveændring.
Southern Blotting	Dette gøres ved hjælp af en autoradiograf, detektion af lys eller farveændring.
Western Blotting	Dette gøres ved at detektere lys eller farveændring.

Sammendrag - Northern vs Southern vs Western Blotting

Blotting er en speciel teknik udviklet til identifikation af specifikt DNA, RNA eller protein fra prøverne. Der er tre separate blottingprocedurer, nemlig nordlige, sydlige og vestlige, for at detektere en bestemt type molekyle. Northern blotting teknik er designet til at detektere en specifik RNA sekvens fra en blanding af RNA. Southern blotting teknik muliggør påvisning af en specifik DNA-sekvens fra en DNA-prøve, og western blotting teknik er udviklet til at identificere et specifikt protein fra en proteinblanding.

Referencer

1. Gibbons, Janay. "Western Blot: Protein Transfer Overview. "Nordamerikanske Journal of Medical Sciences. Medknow Publications & Media Pvt Ltd, marts 2014. Web. 27. marts 2017

2. Brown, T. "Southern blotting. "Nuværende protokoller i immunologi. U. S. National Library of Medicine, maj 2001. Web. 27. marts 2017

3. Han, Shan L. "Northern blot. "Metoder i enzymologi. U. S. National Library of Medicine, 2013. Web. 27. marts 2017

Billede Courtesy:

1. "Northern Blot Scheme" Af RNA405 - Egent arbejde (Public Domain) via Commons Wikimedia

2. "Western blot 114A" Af Amanthabagdon - Egent arbejde (Public Domain) via Commons Wikimedia