Forskel mellem genkloning og PCR | Gene Cloning vs PCR
Nøgleforskel - Genkloning vs PCR
Syntesen af mange kopier af DNA fra et specifikt DNA-fragment kaldes DNA-amplifikation. Der er to primære DNA amplifikationsprocesser, nemlig genkloning og PCR. Nøgleforskellen mellem genkloning og PCR er genkloning producerer de flere kopier af et specifikt gen in vivo ved at konstruere et rekombinant DNA og vokse i en værtsbakterie, mens PCR producerer millioner af kopier af en specifikt DNA-fragment in vitro undergår gentagne cykler af denaturering og syntese.
INDHOLD
1. Oversigt og nøgleforskel
2. Hvad er Gene Cloning
3. Hvad er PCR
4. Side ved side sammenligning - Gene Cloning vs PCR
5. Sammendrag
Hvad er genkloning?
Genkloning er en teknik, der anvendes til at lokalisere og formere et specifikt gen fra det ekstraherede genomiske DNA af en organisme gennem konstruktionen af rekombinant DNA. Genomisk DNA indeholder tusindvis af forskellige gener kodet for proteiner. Når DNA ekstraheres, omfatter det alle mulige gener, det kan bære. Genkloningsteknik har muliggjort påvisning af et specifikt gen fra det totale DNA. Derfor tjener genkloning som et vigtigt redskab i molekylærbiologi.
At lave et genomisk bibliotek af en organisme er afgørende for genkloning, hvis der ikke er nogen anelse om placeringen af det relevante gen i DNA'et. Et genomisk bibliotek fremstilles under anvendelse af de følgende trin.
Trin 1: Ekstraktion af det totale DNA fra en organisme, der indeholder det ønskede gen.
Trin 2: Restriktionsfordøjelse af det ekstraherede DNA for at producere små håndterbare fragmenter. Dette trin lettes af restriktionsendonukleaser.
Trin 3: Valg af en egnet vektor og åbning af vektor-DNA'et under anvendelse af de samme restriktionsendonukleaser. Bakterielle plasmider anvendes almindeligvis som vektorer til at bære fremmed DNA. Plasmider er små cirkler af DNA placeret inden for bakterier.
Trin 4: Kombination af vektor DNA og fragmenteret DNA for at producere rekombinant DNA molekyle. Dette trin styres af DNA ligase.
Trin 5: Overførsel af rekombinante DNA-molekyler til værtsbakterier. Dette trin er kendt som transformation, og det gøres ved hjælp af et varmetræk.
Trin 5: Screening af transformerede bakterieceller på et dyrkningsmedium. En blandet population af transformerede og ikke-transformerede værtsceller opnås ved afslutningen af transformationsprocessen. Som gen af interesse indgår kun i transformerede værtsceller.Derfor er det nødvendigt at vælge transformerede celler. Udvalget er lavet ved hjælp af selektive medier, der indeholder antibiotika. Kun de transformerede celler vokser på dette screeningsmedium, der muliggør udvælgelsen.
Trin 6: Vækst af bakterier til fremstilling af et genbibliotek. I dette trin introduceres de transformerede værtsceller i frisk dyrkningsmedium, som giver optimale vækstkrav. Samlede kolonier på kulturpladerne repræsenterer det genomiske bibliotek af denne organisme.
Trin 7: Det rekombinante DNA-molekyle indeholdende genet af interesse skal screenes fra tusinder af klonede fragmenter af rekombinant DNA. Det kan opnås ved brug af prober, der markerer det specifikke gen eller det specifikke protein, der er resultatet af det gen.
Når først det interesserede gen indeholdende bakteriekolonien er identificeret fra de samlede kolonier, er det muligt at lave millioner af kopier af det rekombinante plasmid, der indeholder genet.
Genkloning bruges til at etablere genbiblioteker, der producerer specielle proteiner, vitaminer, antibiotika, hormoner, sekventering og kortlægning genomer af organismerne, hvilket gør flere kopier af individer DNA i retsmedicin mv.
Figur_1: Gene Cloning
Hvad er PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) er en teknik, der genererer et stort antal kopier af et bestemt DNA-fragment. Eksponentiel amplifikation af en specifik DNA-sekvens opnås ved PCR under in vitro betingelser. Denne teknik er et meget kraftfuldt værktøj i molekylærbiologi, da den kan formere en lille prøve af DNA til en anvendelig mængde. PCR blev introduceret af Kary Mullis i 1983, og denne prisvindende opfindelse skabte en enorm fremgang inden for molekylærbiologi.
PCR-teknik følger gentagne PCR-reaktioner som vist i Figur 02. En PCR-reaktion består af tre hovedtrin, der forekommer ved tre forskellige temperaturer; denaturering af dobbeltstrenget ved DNA ved 94 0 C, annealing af primere ved 68 0 C og strengforlængelse ved 72 0 C. Derfor skal temperaturvariationer, når PCR udføres, holdes yderst vedligeholdt for korrekt replikation. PCR udføres i en PCR-maskine inde i PCR-rør. PCR rør er fyldt med korrekte PCR blandinger indeholdende template DNA, Taq polymerase, primere, dNTP'er og buffer. Denaturering af dobbeltstrenget prøve DNA i enkeltstrenget DNA udføres ved at bryde hydrogenbindingerne mellem komplementære baser ved 94-98 0 C. Derefter udsættes enkelte tråde af template DNA for primere. Der bør leveres et par primere (frem og tilbage), og de bør være termostabile til at tolerere høje temperaturer. Primere er enkeltstrengede korte DNA-sekvenser komplementære til ender af mål-DNA-fragmentet. Syntetiske primere anvendes i PCR. Primerne binder sammen med de komplementære baser af prøve-DNA og initierer syntesen af en ny streng. Dette trin katalyseres af et enzym kaldet Taq polymerase; et termostabilt DNA-polymeraseenzym isoleret fra Thermus auqaticus. Når primere og nukleotider (byggesten) er tilgængelige, konstruerer Taq polymerase den nye streng af DNA, som er komplementær til template DNA.Ved slutningen af PCR-programmet observeres amplificeret DNA-fragment ved anvendelse af gelelektroforese. Hvis yderligere analyse er påkrævet, renses PCR-produktet fra gelen.
PCR er meget nyttig til diagnosticering og overvågning af genetiske og erhvervede sygdomme, identifikation af kriminelle (inden for retsmedicin), undersøgelse af strukturen og funktionen af et målrettet segment af DNA, sekventering og kortlægning af organismer, etc. PCR er blevet en rutinemæssig laboratorieteknik i medicinske og molekylærbiologiske forskningslaboratorier blandt forskere, da den har en bred vifte af applikationer.
Figur_2: Polymerase Chain Reaction
Hvad er forskellen mellem genkloning og PCR?
- diff-artikel Mellemstand før tabel ->
Genkloning vs PCR |
|
| Genkloning er processen med at lave flere kopier af et specifikt gen in vivo gennem rekombinant DNA og transformere til en værtsbakterie. | PCR-teknikken producerer flere kopier af en bestemt DNA-sekvens in vitro gennem gentagne cykler af PCR-reaktioner. |
| Krav til konstruktion af rekombinant DNA | |
| Rekombinant DNA produceres for at lokalisere genet. | Rekombinant DNA produceres ikke. |
| Behov for arbejde | |
| Denne proces er arbejdskrævende. | Der kræves intet arbejde. |
| In vivo eller In vitro-proces | |
| Konstruktion af rekombinant DNA er in vitro, og amplifikationen af DNA er in vivo. | Amplifikation af DNA sker fuldstændigt in vitro. |
Resumé - Gene Cloning vs PCR
Genkloning og PCR er to metoder anvendt til DNA-amplifikation. PCR er en in vitro proces, der fremstiller flere kopier af DNA fra et bestemt DNA-fragment uden brug af rekombinant DNA og en værtsorganisme. Genkloning er primært en in vivo proces, som resulterer i flere kopier af et interesseret gen inde i værtsorganismen via konstruktion af rekombinant DNA. Dette er forskellen mellem genkloning og PCR.
Reference:
1. Griffiths, Anthony JF. "Kloning af et specifikt gen. "Modern Genetisk Analyse. U. S. National Library of Medicine, 1. januar 1999. Web. 22. februar 2017
2. "Polymerase Chain Reaction (PCR). "National Center for Bioteknologi Information. S. National Library of Medicine, n. d. Web. 22 Feb. 2017
Image Courtesy:
1. "Figur 17 01 06" Ved CNX OpenStax - (CC BY 4. 0) via Commons Wikimedia
2. "PCR" Af Madprime - eget arbejde (CC BY-SA 3. 0) via Commons Wikimedia
