Forskel mellem Maxam Gilbert og Sanger Sequencing | Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing

Nøgleforskel - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing

Nucleotider er de grundlæggende strukturelle enheder og byggesten af DNA. DNA-molekyle er sammensat af en polynukleotidkæde. Der findes fire forskellige nukleotider, der findes i DNA. Disse nukleotider er sammensat af fire forskellige nitrogenholdige baser betegnet A (adenin), G (guanin), C (cytosin), T (thymin). Nukleotidernes rækkefølge i DNA-molekylet har stor betydning, da den koder for en vigtig genetisk information for vækst og udvikling af organismer. DNA-sekventering refererer til processen, som bestemmer DNA's nøjagtige nukleotidsekvens. Der er forskellige DNA-sekventeringsmetoder. Maxam Gilbert-sekventering og Sanger DNA-sekventering er to metoder til DNA-sekventering, som tilhører første generations sekventering. Maxam Gilbert-sekventeringsprocedure bestemmer basesekvensen ved kemisk spaltning af de 5'-endemærkede DNA-fragmenter fortrinsvis ved hver af fire nukleotider og gelelektroforese. Sanger-sekventeringsprocedure bestemmer nukleotidsekvensen ved syntetisering af enkeltstrenget DNA ved anvendelse af DNA-polymerase og dideoxynukleotider og gelelektroforese. Dette er nøgleforskellen mellem Maxam Gilbert og Sanger Sequencing.

INDHOLD

1. Oversigt og nøgleforskel

2. Hvad er Maxam Gilbert

3. Hvad er Sanger Sequencing

4. Side om side sammenligning - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing

5. Sammendrag

Hvad er Maxam Gilbert Sequencing?

Maxam Gilbert-sekventering, også kendt som kemisk sekventeringsfremgangsmåde , er en teknik, som blev udviklet til bestemmelse af nukleotidernes rækkefølge i DNA. Denne metode blev introduceret af Walter Gilbert og Alan Maxam i 1976 og blev populær, da den kan udføres direkte med oprenset DNA. Maxam Gilbert-metoden tilhører den første generation af DNA-sekventering, og det var den første sekventeringsmetode, der anvendes bredt af forskere.

Basisprincippet for denne metode ligger i begrænsningen af de endemærkede DNA-fragmenter ved specifikke baser ved basespecifikke kemikalier og betingelser og adskillelse af de mærkede fragmenter ved elektroforese som vist i figur 01. Fragmenter adskilles i overensstemmelse med deres størrelser på gelen. Da fragmenterne er mærket, kan DNA-molekylets sekvens let udledes.

Maxam gilbert-metoden bruger basisspecifikke kemikalier til at bryde DNA på specifikke baser. To almindelige kemikalier benævnt dimethylsulfat og hydrazinkemikalier anvendes til selektivt at angribe puriner og pyrimidiner.

Maxam Gilbert-sekventeringsmetode udføres via flere trin som følger.

Oprensning af DNA-sekvensen under anvendelse af restriktionsendonukleaser
Mærkning af enderne af DNA-fragmenterne ved tilsætning af radioaktive phosphater
Rensning af de mærkede fragmenter fra ikke-mærkede fragmenter ved gelelektroforese
Separation af end- mærket DNA i fire rør og behandle med basespecifikke kemikalier separat
Elektroforese af indholdet af hvert rør på separate linjer på en gel og fragment separation efter deres længde.
Påvisning af fragmenterne ved autoradiograf.

Figur 01: Maxam Gilbert Sequencing

Hvad er Sanger Sequencing?

Sanger Sequencing er en sekventeringsmetode udviklet af Frederick Sanger og hans kolleger i 1977 for at bestemme bundsekvensen for et givet DNA-fragment. Det er også kendt som kæde terminering sekventering eller Dideoxy sekventeringsmetode. Denne metode virker på princippet om selektiv inkorporering af kæde-terminerende dideoxynukleotider (ddNTP'er) såsom ddGTP, ddCTP, ddATP og ddTTP ved DNA-polymerase under syntesen af enkeltstrenget DNA for at afslutte strengdannelse. Dideoxynukleotider mangler 3'-OH-grupper til dannelse af phosphodiesterbindinger med tilstødende nukleotid. Strømdannelsen stopper således, når en ddNTP er inkorporeret i nydannende streng under sanger-sekventering.

I denne metode udføres fire separate DNA syntese reaktioner (PCR) i fire separate rør med en type ddNTP. Der leveres også andre krav til rørene til PCR, herunder primere, dNTP'er, Taq-polymerase, specifikke betingelser osv. Fire separate reaktioner udføres i fire rør med fire blandinger. Efter PCR-reaktioner er de resulterende DNA-fragmenter denatureret og separeret ved gelelektroforese. Derefter visualiseres fragmenterne ved anvendelse af enten en mærket (radioaktiv eller fluorescerende) primer eller dNTP'er som vist i figur 02.

Figur 02: Sangersekvensering

Hvad er forskellen mellem Maxam Gilbert og Sanger Sequencing?

- diff Artikel Mellem før bord ->

Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
Maxam Gilbert-sekventering er den første teknik udviklet til DNA-sekventering.	Sanger-sekventeringsmetode blev indført efter Maxam Gilbert-sekventeringsmetoden.
Anvendelse
Denne metode anvendes sjældent.	Sanger-sekventering anvendes rutinemæssigt til sekventering.
Anvendelse af farlige kemikalier
Det bruger farlige kemikalier.	Anvendelse af farlige kemikalier er begrænset i forhold til Maxam Gilbert-metoden.
Mærkning til detektion
Denne metode anvender radioaktiv P ³² til mærkning af enderne af DNA-fragmenterne.	Sanger-sekventering bruger radioaktivt eller fluorescensmærkede ddNTP'er.

Resumé - Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing

Maxam Gilbert og Sanger-sekventering er to typer DNA-sekventeringsteknikker, der kommer under første generations DNA-sekventering.Maxam Gilbert-sekventering er den første metode, der blev introduceret til DNA-sekventering i 1976, og den udføres ved at bryde de slutmærkede DNA-fragmenter med basespecifikke kemikalier. Derfor er det kendt som kemisk sekventering. Sanger-sekventeringsmetode blev introduceret i 1977 og er baseret på ddNTP-drevne kædetermineringsreaktioner. Sanger sekventeringsmetode populær end Maxam Gilbert metode på grund af flere ulemper ved Maxam Gilbert metode som for stort tidsforbrug, anvendelse af farlige kemikalier osv. Dette er forskellen mellem Maxam Gilbert og Sanger sekvensering.

Referencer:

1. Maxam, A. M, og Walter Gilbert. "En ny metode til sekventering af DNA. "Proceedings of the National Academy of Sciences. National Acad Sciences, 9. december 1976. Web. 30. marts 2017

2. Heather, James M., og Benjamin Chain. "Sekvensen af sekvenser: Historien om sekventering af DNA. "Genomics. Academic Press, Jan. 2016. Web. 30. marts 2017

3. Pareek, Chandra Shekhar, Rafal Smoczynski og Andrzej Tretyn. "Sekventeringsteknologier og genom sekventering. "Journal of Applied Genetics. Springer-Verlag, nov. 2011. Web. 30. marts 2017

Billede Courtesy:

1. "Maxam gilbert sequencing" Ved flere gange på engelsk Wikipedia (CC BY 3. 0) via Commons Wikimedia

2. "Sanger-sequencing" Af Estevezj - Egentligt arbejde (CC BY-SA 3. 0) via Commons Wikimedia