Forskel mellem RT PCR og QPCR | RT PCR vs QPCR

Nøgleforskel - RT PCR vs QPCR

Polymerase Chain Reaction er en teknik, der anvendes til at amplificere en specifik region af DNA in vitro. På grund af opfindelsen af denne teknik af Kary Mullis i 1983 kan forskere gøre tusind til millioner af kopier af specifikke DNA-fragmenter til forskningsformål. I øjeblikket er det blevet en fælles og rutinemæssigt udført teknik i kliniske og forskningslaboratorier til en bred vifte af applikationer. Der er variationer af traditionel PCR-teknik som RT PCR, indlejret PCR, multiplex PCR, Q PCR, RT-QPCR osv. RT PCR og Q PCR er to vigtige variationer af PCR. Hovedforskellen mellem RT PCR og Q PCR er, at RT PCR bruges til at detektere genekspression ved at skabe komplementære DNA (cDNA) transkripter fra RNA , mens Q PCR anvendes kvantitativt måle PCR-produkterne i realtid ved hjælp af fluorescerende farvestoffer.

INDHOLD

1. Oversigt og nøgleforskel

2. Hvad er RT PCR

3. Hvad er QPCR

4. Side ved side sammenligning - RT PCR vs QPCR

5. Sammendrag

Hvad er RT PCR?

Reverse transkriptionspolymerasekædereaktion (RT PCR) er en variant af PCR, der anvendes til at detektere RNA-ekspression. Det er en meget vigtig metode til at detektere mRNA-ekspression i væv. RT PCR anvendes, når udgangsmaterialet i prøven er RNA. I RT PCR konverteres template mRNA først til komplementært DNA. Dette trin katalyseres af enzymet omvendt transkriptase, og processen er kendt som revers transkription. For det andet anvendes traditionel PCR til det nyligt syntetiserede cDNA til amplifikationen.

RT PCR er en meget følsom teknik, der kræver en relativt lille mængde RNA-prøve. RT PCR anvendes almindeligvis ved diagnosticering og kvantificering af RNA-arter, især RNA-vira, såsom human immunodeficiencyvirus og hepatitis C-virus.

Figur 01: RT PCR Teknik

Hvad er QPCR?

Kvantitativ PCR (QPCR) er en variant af PCR, som bruges til kvantitativt at måle PCR-produkterne. Det kaldes også real-time polymerasekædereaktion, da det måler forstærkningen af realtid ved hjælp af realtid PCR-maskine. Det er en egnet metode til bestemmelse af mængden af en målsekvens eller et gen, der er til stede i en prøve. Det interessante ved QPCR er, at det kombinerer både forstærkning og ægte kvantificering i et enkelt trin. Derfor kan behovet for gelelektroforese i detektion elimineres ved hjælp af QPCR-teknik. QPCR bruger fluorescerende farvestoffer til at mærke PCR-produkter under PCR-reaktionerne, som i sidste ende fører til direkte kvantificering.Når PCR-produkterne akkumuleres, akkumuleres også fluorescerende signaler, og det vil blive målt af realtidsmaskinen. QPCR kan kombineres med RT PCR. Det er kendt som RT - QPCR eller QRT - PCR og betragtes som en mest kraftfuld, følsom og kvantitativ metode til påvisning af RNA - niveauer i cellerne eller vævene.

SYBR Green og Taqman er to metoder til at detektere eller se amplifikationsprocessen i realtid PCR. SYBR Green metode udføres ved anvendelse af et fluorescerende farvestof kaldet SYBR green og detekterer amplifikationen ved at binde farvestoffet til fremstilling af dobbeltstrenget DNA. Taqman udføres under anvendelse af dobbeltmærkede prober og detekterer amplifikationen ved nedbrydning af sonden ved hjælp af Taq polymerase og frigivelser af fluoroforet som vist i figur 02. Begge metoder overvåger fremskridtet i amplifikationsprocessen og rapporterer mængden af produktet realtid.

Realtids-PCR har en bred vifte af anvendelser, såsom genekspressionskvantificering, mikroRNA og ikke-kodende RNA-analyse, SNP genotyping, detektion af kopieringsvarianter, påvisning af sjældne mutationer, påvisning af genetisk modificerede organismer, påvisning af smitsomme stoffer osv..

Figur 02: Kvantitativ PCR-teknik

Hvad er forskellen mellem RT PCR og QPCR?

- diff Artikel Mellem før tabel ->

RT PCR vs QPCR
RT PCR er en teknik, der anvendes til at detektere genekspression ved amplifikation.	QPCR er en teknik, der amplificerer DNA og kvantificerer PCR-produkterne i realtid.
Inddragelse af Reverse Transcriptase Enzyme
Enzym revers transkriptase anvendes til RT PCR.	Enzym revers transkriptase anvendes ikke til QPCR.
Anvendelse af fluorescensmærkede molekyler
Fluorescensmærkede farvestoffer eller prober anvendes ikke til RT PCR.	Fluorescensmærkede farvestoffer eller prober anvendes til QPCR.
Kvantificering af PCR-produkt
Medmindre det er koblet til QPCR, kvantificerer RT PCR ikke PCR-produktet.	QPCR måler kvantitativt PCR-produktet.
Udgangsmateriale
Udgangsmateriale er mRNA.	Udgangsmateriale er DNA.
Syntese af cDNA
Komplementært DNA produceres under RT PCR.	Komplementært DNA produceres ikke under QPCR.

Sammendrag - RT PCR vs QPCR

RT PCR og QPCR er to versioner af traditionel PCR. RT PCR-teknik udføres for mRNA-prøver, og den drives af revers transkription og produktion af cDNA. QPCR bruges til at kvantificere PCR-produkter i realtid PCR termiske cyklusser ved brug af fluorescerende farvestoffer eller mærkede prober. I QPCR er mængden af PCR-produkt repræsenteret af de udstrålede fluorescerende signaler af prøven. RT PCR anvendes populært som en amplifikationsproces, mens QPCR almindeligvis anvendes som en kvantificeringsproces. Dette er forskellen mellem RT PCR og QPCR.

Referencer:

1. Deepak, SA, KR Kottapalli, R. Rakwal, G. Oros, KS Rangappa, H. Iwahashi, Y. Masuo og GK Agrawal. "Real-Time PCR: Revolutionerende Detection og Expression Analysis of Genes. "Nuværende Genomics.Bentham Science Publishers Ltd., juni 2007. Web. 3. april 2017

2. Zeka, Fjoralba, Katrien Vanderheyden, Els De Smet, Claude A. Cuvelier, Pieter Mestdagh og Jo Vandesompele. "Retfærdig og følsom RT-qPCR baseret genekspression analyse af FFPE prøver. "Nature News. Nature Publishing Group, 22. februar 2016. Web. 3. april 2017

3. Overbergh, L., A. Giulietti, D. Valckx, B. Decallonne, R. Bouillon og C. Mathieu. "Anvendelsen af realtids-omvendt transkriptase-PCR til kvantificering af cytokingenudtryk. "Journal of Biomolecular Techniques: JBT. Association of Biomolecular Resource Facilities, marts 2003. Web. 03. april 2017

Billede Courtesy:

1. "Taqman" Af Bruger: Braindamaged - Egent arbejde af den originale uploader (Public Domain) via Commons Wikimedia

2. "Reverse transkriptionspolymerasekædereaktion" Af Jpark623 - Egentligt arbejde (CC BY-SA 3. 0) via Commons Wikimedia