Forskel mellem sanger sekventering og pyrosequencing | Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Nøgleforskel - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
DNA sekventering er meget vigtigt for DNA analyse siden viden af det korrekte nukleotidarrangement på et bestemt DNA-område afslører mange vigtige oplysninger om det. Der er forskellige DNA-sekventeringsmetoder. Sanger-sekventering og Pyrosequencing er to forskellige DNA-sekventeringsmetoder, der i vid udstrækning anvendes i molekylærbiologi. Hovedforskellen mellem Sanger-sekventering og Pyrosequencing er, at Sanger-sekventering bruger dideoxynucleotider til at terminere syntesen af DNA for at læse nukleotidsekvensen, mens pyrosequencing detekterer pyrophosphatfrigivelsen ved at inkorporere nukleotiderne og syntetisere den komplementære sekvens for at læse den nøjagtige rækkefølge af sekvens.
INDHOLD
1. Oversigt og nøgleforskel
2. Hvad er Sanger Sequencing
3. Hvad er Pyrosequencing
4. Side ved side sammenligning - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
5. Sammendrag
Hvad er Sanger Sequencing?
Sanger-sekventering er en første generation af DNA-sekventeringsmetode udviklet af Frederick Sanger og hans gymnasier i 1977. Den er også kendt som Chain Termination Sequencing eller Dideoxy-sekventering , da den er baseret på kæde terminering af dideoxynucleotider (ddNTP'er). Denne metode blev udbredt i mere end 30 år, indtil New Generation Sequencing (NGS) blev udviklet. Sanger-sekventeringsteknik muliggjorde opdagelsen af den korrekte nukleotidrækkefølge eller vedhæftningen af et bestemt DNA-fragment. Den er baseret på den selektive inkorporering af ddNTP'er og terminering af DNA-syntese under in vitro DNA-replikation. Fraværet af 3'-OH-grupper til at fortsætte fosfodiesterbindingsdannelsen mellem tilstødende nukleotider er et unikt træk ved ddNTP'er. Således ophører kædelængelsen, når ddNTP er vedhæftet, og ophører fra dette punkt. Der er fire ddNTP'er - ddATP, ddCTP, ddGTP og ddTTP - anvendt i Sanger-sekventering. Disse nukleotider stopper DNA-replikationsprocessen, når de inkorporeres i dyrkningsstrengen af DNA og resulterer i varierende længder af kort DNA. Kapillærgelelektroforese anvendes til at organisere disse korte DNA-tråde ved deres størrelser på en gel som vist i figur 01.
Figur 2: Kapillærgelelektroforese af syntetiseret kort DNA
Til
in vitro replikation af DNA, bør der ikke gives nogle krav. De er DNA-polymeraseenzym, template DNA, oligonukleotidprimere og deoxynukleotider (dNTP'er). Ved Sanger-sekventering udføres DNA-replikation i fire separate reagensglas sammen med fire typer ddNTP'er separat. Deoxynukleotider erstattes ikke fuldstændigt af de respektive ddNTP'er. En blanding af den særlige dNTP (for eksempel dATP + ddATP) indgår i røret og replikeres. Fire separate rørprodukter køres på en gel i fire separate brønde. Derefter ved at læse gelen, kan sekvensen konstrueres som vist i figur 02.
Sanger sekventering er en vigtig teknik, der hjælper inden for mange områder af molekylærbiologi. Human genomprojekt blev gennemført med succes ved hjælp af Sanger-sekventeringsbaserede metoder. Sanger-sekventering er også nyttig i mål-DNA-sekventering, kræft- og genetisk sygdomsforskning, genekspressionanalyse, humanidentifikation, patogenetektion, mikrobiel sekventering etc.
Der er flere ulemper ved Sanger-sekventering:
DNA'ens længde er sekventeret må ikke være længere end 1000 basepar
- Kun en streng kan sekventeres ad gangen.
- Processen er tidskrævende og dyr.
- Derfor blev nye avancerede sekventeringsteknikker udviklet med tiden til at overvinde disse problemer. Sanger-sekventering er dog stadig i brug på grund af dets yderst præcise resultater op til ca. 850 basisparlængdefragmenter.
Hvad er Pyrosequencing?
Pyrosequencing er en ny DNA-sekventeringsteknik baseret på "sekventering ved syntese". Denne teknik er afhængig af påvisningen af pyrophosphatfrigivelse ved nukleotidindarbejdelsen. Processen anvendes af fire forskellige enzymer: DNA polymerse, ATP sulfurylase, luciferase og apyrase og to substrater adenosin 5 'phosphosulfat (APS) og luciferin.
Processen starter med primerbindingen med den enkeltstrengede DNA-template og DNA-polymerase starter inkorporeringen af nukleotider, som er komplementære til den. Når nukleotiderne går sammen (nucleinsyrepolymerisation), frigives det pyrophosphat (to fosfatgrupper bundet sammen) grupper og energi. Hver nukleotidaddition frigiver ækvimolær mængde pyrophosphat. Pyrophosphat omdannes til ATP ved ATP sulfurylase i nærvær af substrat APS. Den genererede ATP driver den luciferase-medierede omdannelse af luciferin til oxyluciferin, hvilket producerer synligt lys i mængder, der er proportionale med mængden af ATP'er. Lys detekteres af en foton detekteringsenhed eller ved fotomultiplikator og opretter et pyrogram. Apyrase nedbryder ATP og ikke-inkorporerede dNTP'er i reaktionsblandingen. dNTP-tilsætning udføres en gang ad gangen. Da tilsætningen af nukleotid er kendt ifølge inkorporering og påvisning af lys, kan sekvensen af skabelonen bestemmes.Pyrogram anvendes til at generere nukleotidsekvensen af prøve-DNA'et som vist i figur 03.
Pyrosequencing er meget vigtig i enkelt nukleotidpolymorfisanalyse og sekventering af korte strækninger af DNA. Den høje nøjagtighed, fleksibilitet, nemme automatisering og parallelbehandling er fordelene ved pyrosequencing over Sanger-sekventeringsteknikker.
Figur 03: Pyrosequencing
Hvad er forskellen mellem Sanger Sequencing og Pyrosequencing?
- diff Artikel Mellem før Tabel ->
Sanger Sequencing vs Pyrosequencing
Sanger-sekventering er en DNA-sekventeringsmetode baseret på den selektive inkorporering af ddNTP'er ved DNA-polymerase og kædeafslutning. |
|
| Pyrosequencing er en DNA-sekventeringsmetode baseret på påvisningen af pyrophosphatfrigivelse ved inkorporering af nukleotid. | Anvendelse af ddNTP |
| ddNTP'er bruges til at terminere DNA-replikationen | |
| ddNTP'er anvendes ikke. | Enzymer involveret |
| DNA-polymerase anvendes. | |
| Fire enzymer anvendes: DNA-polymerase, ATP-sulfurylase, luciferase og apyrase. | Underlag Brugt |
| APS og Luciferin anvendes ikke. | |
| Adenosin 5 'phosphosulfat (APS) og luciferin anvendes. | Maksimal temperatur |
| Dette er en langsom proces. | |
| Dette er en hurtig proces. | Sammendrag - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing |
Sanger-sekventering og Pyrosequencing er to DNA-sekventeringsmetoder, der anvendes i molekylærbiologi. Sanger-sekventering konstruerer rækkefølgen af nukleotiderne i rækkefølge ved at afslutte kædeforlængelsen, mens pyrosequensionen konstruerer nøjagtige rækkefølge af nukleotiderne i rækkefølge ved inkorporering af nukleotider og påvisning af frigivelsen af pyrophosphater. Derfor er den største forskel mellem Sanger-sekventering og Pyrosequencing, at Sanger-sekventering virker på sekventering ved kædeafslutning, mens pyrosequencing virker på sekventering ved syntese.
Reference:
1. Fakruddin, Md og Abhijit Chowdhury. "Pyrosequencing-et alternativ til traditionel sanger-sekventering. "American Journal of Biokemi og Bioteknologi. Science Publications, 02 Mar. 2012. Web. 28. februar 2017.
2. "Sanger-sekventering. "Sanger-sekventering - ScienceDirect-emner. N. p., n. d. Web. 28 Feb. 2017
Image Courtesy:
1. "Didesoxy-Methode" Af Christoph Goemans (modifiziert) - Dr. Norman Mauder, der er baseret på Christoph Goemans (CC BY-SA 3. 0) via Commons Wikimedia
2. "Sanger-DNA-seq" Af Enzo på det polske sprog Wikipedia (CC BY-SA 3. 0) via Commons Wikimedia
3. "Pyrosequencing" ved mikrobiologibytes (CC BY-SA 2. 0) via Flickr
