Forskel mellem NGS og Sanger Sequencing | NGS vs Sanger Sequencing
Nøgleforskel - NGS vs Sanger Sequencing
Next Generation Sequencing (NGS) og Sanger Sequencing er to typer nukleotidsekvenseringsteknikker udviklet gennem tiden. Sanger-sekventeringsmetode blev udbredt i mange år, og NGS erstattede det for nylig på grund af dets fordele. Nøgleforskellen mellem NGS og Sanger Sequencing er, at NGS arbejder på princippet om sekventering af millioner af sekvenser samtidigt på en hurtig måde gennem et sekventeringssystem, mens Sanger Sequencing arbejder på princippet om kædeafslutning på grund af selektiv inkorporering af dideoxynucleotider ved DNA-polymeraseenzym under DNA-replikationen og resulterende fragment-separation ved kapillærelektroforese.
INDHOLD
1. Oversigt og nøgleforskel
2. Hvad er nukleotidsekvensering
3. Hvad er NGS
4. Hvad er Sanger Sequencing
5. Side ved side sammenligning - NGS vs Sanger Sequencing
6. Sammendrag
Hvad er nukleotidsekvensering?
Genetisk information opbevares i nukleotidsekvenserne af DNA'en eller RNA'et af en organisme. Processen til bestemmelse af den korrekte rækkefølge af nukleotider (ved anvendelse af fire baser) i et givet fragment (i et gen, klynge af gener, kromosom og fuldstændigt genom) er kendt som nukleotidsekventering . Det er meget vigtigt i genomiske undersøgelser, retsmedicinske undersøgelser, virologi, biologisk systematisk, medicinsk diagnose, bioteknologi og på mange andre områder for at analysere genernes struktur og funktion. Der er forskellige typer af sekventeringsmetoder udviklet af forskere. Blandt dem blev Sanger-sekvensering udviklet af Frederick Sanger i 1977 meget udbredt og populeret i lang tid indtil Next Generation Sequencing erstattede den.
Hvad er NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) er et udtryk, der bruges til at referere til moderne high-throughput sekvenseringsprocesser. Det beskriver en række forskellige moderne sekvenseringsteknologier, der revolutionerede genomiske studier og molekylærbiologi. Disse teknikker er Illumina-sekventering, Roche 454-sekventering, Ion Proton-sekventering og SOLiD-sekvensering (Sequencing by Oligo Ligation Detection). NGS-systemer er hurtigere og billigere. Fire vigtigste DNA-sekventeringsmetoder anvendes i NGS-systemer nemlig; pyrosequencing, sekventering ved syntese, sekventering ved ligering og ion-halvleder-sekventering. Et stort antal DNA- eller RNA-tråde (millioner af) kan sekventeres parallelt. Det tillader sekventering af hele genomet af organismer inden for en kort periode, i modsætning til Sanger-sekventering, som tager mere tid.
NGS har mange fordele i forhold til konventionel sekventerings-Sanger-metode. Det er en hurtigere, mere præcis og omkostningseffektiv proces, der kan udføres med en lille prøvestørrelse. NGS kan anvendes i metagenomiske undersøgelser ved påvisning af variationer inden for et individuelt genom på grund af insertioner og deletioner mv og i analysen af genuttryk.
Figur_1: Udviklingen i NGS-sekventering
Hvad er Sanger Sequencing?
Sanger Sequencing er en sekventeringsmetode udviklet af Frederick Sanger og hans kolleger i 1977 for at bestemme den nøjagtige nukleotidordre af et givet DNA-fragment. Det er også kendt som kæde terminering sekventering eller Dideoxy sekventering . Arbejdsprincippet for denne fremgangsmåde er terminering af strengsyntesen ved selektiv inkorporering af en kæde-terminerende dideoxynucleotider (ddNTP'er) såsom ddGTP, ddCTP, ddATP og ddTTP ved DNA-polymerase under replikationen af DNA. Normale nukleotider har 3'-OH-grupper til dannelse af en phosphodiesterbinding mellem tilstødende nucleotider for at fortsætte strengdannelsen. Imidlertid mangler ddNTP'er denne 3'-OH-gruppe og kan ikke danne phosphodiesterbindinger mellem nukleotider. Derfor er kædelængelsen ophørt.
I denne metode tjener det enkeltstrengede DNA, som skal sekventeres, som template-strengen til in vitro DNA-syntese. Andre krav er oligonukleotidprimer, deoxynukleotidprecursorer og DNA-polymeraseenzym. Når de flankerende ender af målfragmentet er kendte, kan primere let konstrueres til DNA-replikation. Fire separate DNA syntese reaktioner udføres i fire separate rør. Hvert rør har separate ddNTP'er sammen med andre krav. Fra det specifikke nukleotid tilsættes en blanding af dNTP'er og ddNTP'er. På samme måde udføres fire separate reaktioner i fire rør med fire blandinger. Efter reaktionerne udføres påvisningen af DNA-fragmenter og omdannelse af fragmentmønsteret til sekvensinformation. Resulterende DNA-fragmenter varmedesigneres og separeres ved gelelektroforese. Hvis der anvendes radioaktive nukleotider, kan båndmønsteret i polyacrylamidgelen visualiseres ved autoradiografi. Når denne metode anvender de fluorescensmærkede dideoxynukleotider, kan den mildnes ned på gel'en, der læses og passeres gennem en laserstråle, der skal detekteres af fluorescerende detektoren. For at undgå fejl, der kan opstå, når en sekvens læses af øjet og indtastes manuelt i en computer, udviklede denne metode sig til brugen af automatiseret sequencer kombineret med computeren.
Dette er den metode, der bruges til at sekvensere DNA fra Human Genome-projektet. Denne metode er stadig i brug med avancerede ændringer, fordi den giver nøjagtig sekvensinformation til trods for at den er en dyr og langsom proces.
Figur_2: Sanger Sequencing
Hvad er forskellen mellem NGS og Sanger Sequencing?
- diff Artikel Mellem før tabel ->
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| Næste Generations Sequencing (NGS) refererer til moderne high-throughput sekvenseringsprocesser.Det beskriver en række forskellige moderne sekvenseringsteknologier. | Sanger Sequencing er en sekventeringsmetode udviklet af Frederick Sanger til bestemmelse af den nøjagtige nukleotidordre af et givet DNA-fragment. |
| Omkostningseffektivitet | |
| NGS er en billigere proces, fordi den reducerer tid, menneskekraft og kemikalier. | Dette er en kostbar proces, fordi det tager tid, mandkraft og flere kemikalier. |
| Hastighed | |
| Dette er hurtigere, da både kemisk detektion og signal detektion af mange tråde sker parallelt. | Dette er tidskrævende, da kemisk detektion og signal detektion sker som to separate processer, og kun på streng kan læse ad gangen. |
| Pålidelighed | |
| NGS er pålidelig. | Sanger-sekventering er mindre pålidelig |
| Sample Size | |
| NGS kræver mindre mængde DNA. | Denne metode har brug for en stor mængde template DNA. |
| DNA-baser pr. Sekventeret fragment | |
| Antal DNA-baser pr. Sekventeret fragment er lavere end Sanger-metoden | Genererende sekvenser er længere end NGS-sekvenser. |
Sammenfatning - NGS vs Sanger Sequencing
NGS og Sanger Sequencing er nukleotidsekventeringsteknikker, der i vid udstrækning anvendes i molekylærbiologi. Sanger-sekventering er en tidlig sekventeringsmetode, som blev erstattet af NGS. Hovedforskellen mellem NGS og Sanger Sequencing er, at NGS er en hurtigere, mere præcis og omkostningseffektiv proces end Sanger-sekventering. Begge teknikker skabte store udbrud inden for genetik og bioteknologi.
Reference:
1. Nowrousian, Minou. "Next Generation Sequencing Techniques for Eukaryotic Microorganisms: Sequencing-baserede løsninger til biologiske problemer. "Eukaryotisk celle. American Society for Microbiology, september 2010. Web. 18. februar 2017
2. Sanger, F., S. Nicklen og A. R. Coulson. "DNA-sekventering med kæde-terminerende inhibitorer. "Procedurer af National Academy of Sciences 74. 12 (1977): 5463-467. Web.
3. Liu, Lin, Yinhu Li, Siliang Li, Ni Hu, Yimin He, Ray Pong, Danni Lin, Lihua Lu og Maggie Law. "Sammenligning af Next Generation Sequencing Systems. "Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012 (2012): 1-11. Web.
Image Courtesy:
"Sanger-sequencing" Af Estevezj - Egentligt arbejde (CC BY-SA 3. 0) via Commons Wikimedia
"Udviklingen i næste generations sekventering" Af Nederbragt, Lex (2012) CC BY 3. 0) via Commons Wikimedia
